生物荧光肿瘤体外药敏检测技术（ATP-TCA）
的临床应用和注意事项

张  伟

　　编者按：化学治疗是治疗恶性肿瘤的常规有效手段之一[1]。由于肿瘤本身存在个体差异性，即便是同一组织学类型、分化程度相同肿瘤，对药物敏感谱也显著不同。如果在用药前缺乏该癌症患者对化疗药物敏感性和耐药性的直接实验依据，在化疗方案的制定上不可避免地存在一定的盲目性。选药物不准，不仅将有损患者身体，更重要的是可诱导肿瘤细胞产生对多种药物的多药耐药，贻误治疗时机。因此在临床实践中亟需一种能在治疗前为患者筛选敏感药物的技术方法，实现肿瘤患者化疗方案的个体化。

　　一个理想的体外药敏检测方法应该具备的以下特点：方法适度敏感，能测定到化疗药物作用后的1000-3000个活细胞；.操作简便，实验周期在一周之内；体外实验结果与体内治疗反应间一致性高；标本可评价率高；操作流程标准化和评价标准规范化，结果判定可靠、客观；具备产业化条件。
　　目前除了本文介绍的生物荧光肿瘤体外药敏检测技术之外，用于体外药敏检测方法还有软琼脂克隆形成实验，四唑蓝(MTT)比色法和氚标记胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法等。上述3种方法由于存在着重要技术缺陷，距理想的体外药敏检测方法相差较远（表1）。ATP-TCA技术是目前较为理想的体外药敏检测方法。

表1：常见体外药敏检测方法的技术缺陷

体外药敏检测方法	存　在　问　题
软琼脂集落形成实验	部分标本不能形成集落，可评价率低（30%~40%）  实验周期长，且需在显微镜下人工计数，繁琐，结果不客观  仅能用于测试杀伤可增殖肿瘤细胞的药物  方法难以标准化，各实验室间结果可比性差  阳性预测值较低，仅有40%~60%
四唑蓝比色法(MTT)	敏感性和重复性差，最低仅能检测500个细胞  有效量程在2.0以内
3H-TdR掺入法	实验人员接触放射，不利于健康和环保  标本可评价率低，仅有70%~80%  仅能用于测试杀伤增殖期肿瘤细胞的药物  阳性预测值较低，仅有53%~75%  假阴性率高，重复性差

　　一、生物荧光肿瘤体外药敏检测技术原理和特点
　　生物荧光技术的原理是荧光酶在有氧条件下,可以和荧光素结合后催化ATP（三磷酸腺苷）转变成AMP（磷酸腺苷）,同时释放出荧光（波长为562 nm），这个过程可以表示为如下方程式：
 
　　反应中所释放的荧光强度与ATP含量呈正相关。在正常生理条件下，胞内ATP的数量恒定，细胞死亡时，ATP迅速水解，因此所测得的荧光强度可以反映活细胞数。实验表明，在活细胞数20～160000个之间，细胞数与荧光强度呈直线关系。这项技术用于体外同时测定多种抗癌药物对肿瘤细胞的杀伤活性时，被称为生物荧光肿瘤体外药敏检测技术（ATP-TCA）。
　　ATP-TCA操作流程简述如下：无菌取得的肿瘤手术标本，先经机械剪切，再经酶消化，得到单细胞悬液。细胞接种与96孔板，加不同浓度的待测药物，并设无药对照和最大抑制对照（本底）。培养5天，开始测定，即提取ATP后，加荧光素和荧光酶混合液后，立即在荧光扫描仪上测定荧光强度，结果传输计算机。配套的分析软件可自动计算药物各浓度抑制率、绘制抑制曲线和IC50、IC90，并可按照设定好的评估标准评估药物作用。
　　ATP-TCA法与MTT法在细胞培养阶段是类似的，差别主要在测定阶段。由于ATP-TCA法测的是自发光，相当灵敏，本底极低，量程极宽，读数可从0到数十万，而MTT法测定是在酶标仪上测定有色最终产物（MTT被线粒体脱氢酶还原成蓝紫色结晶物甲臜）的光密度值，灵敏性较差，本底较高，且最大光密度读数只能到2.0，可评价区间窄。另外，MTT法标本可评价率低于ATP-TCA法。还需指出的重要一点是MTT法尚无配套的分析软件，结果不能传输电脑进行结果自动分析，人工评估结果人为因素过大。因此ATP-TCA法比其它体外药敏检测方法更适宜于常规临床药敏检测，已得到广泛认可。

　　二、ATP-TCA体外药敏实验与临床相关性的研究
　　近20年欧洲、美国和日本进行了大量的ATP-TCA体外药敏实验与临床相关性研究，所涉及的肿瘤类型包括卵巢癌、胃肠道肿瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌和白血病等。资料表明ATP-TCA的体外药敏测试结果与临床疗效具有较好的相关性（表2）。ATP-TCA的特点总结如表3。

表2： ATP-TCA与临床疗效相关性研究资料

时间	国家	研究人	肿瘤类型	结　　论
1988年	美国	Sevin等	卵巢癌	阳性预测值：92%，阴性预测值：90%  整体预测精确值：86%
1990年	日本	Jinushi等	胃肠道癌	整体预测精确性为88.9%
1993年	瑞士	Koechli等	乳腺癌	阳性预测值：90%，阴性预测值：86%  整体预测精确值：85%
1995年	美、英、德  三国协作	Andreotti等	顺铂耐受卵巢癌	整体预测精确值：92%
1996年	英国	Cree等	III/ IV期乳腺癌	整体预测精确值：76％
1997年	日本	Kawamura等	胃肠道肿瘤	阳性预测值：64%，阴性预测值：100%  整体预测精确值：84%
2000年	美国	Konecny等	FIGO Ⅲ期卵巢癌	阳性预测值：66%，阴性预测值：89%  敏感性：95%，特异性：44%
2000年	德国	Mollgard等	急性非淋巴细胞性白血病	阳性预测值：86%，阴性预测值：100%
2001年	美国	O'Meara等	上皮性卵巢癌	阳性预测值：83%，阴性预测值：56.5%
2003年	德国	Kurbacher等	卵巢癌 乳腺癌	ORR:75% vs35%, OAS: 28.5M vs14M  Avner BP乳腺癌 P<0.0001
2003年	中国	张凯等	卵巢癌	阳性预测值：94.7%  阴性预测值：84.6%  特异性：91.7% 敏感性：91% 整体预测值：86%

表3：ATP-TCA技术的特点

敏感性高	可检测最少20个细胞
标本可评价率高	标本可评价率在90%以上
快速检测	完成ATP检测仅需30分钟
量程宽	检测线性范围为20～160000个细胞/孔（96孔培养板）
精密度好	变异系数（CV）小于10%，在国家标准（10%）的范围内
体内体外符合率高	乳腺癌和卵巢癌实验结果和体内药物治疗反应一致性高达85%
检测效率高	同时动态检测评估化疗药物6个剂量下对肿瘤的杀伤作用
高通量检测	适合96、384、1536孔板检测分析，Z’因子为0.84
自动化程度高	实验数据计算机软件自动分析，分析结果客观可靠

　　三、ATP-TCA在临床治疗上的应用
　　1.为治疗后复发的患者筛选敏感性药物，设计个体化治疗方案：
　　1998年，德国科隆大学医学中心Kurbacher等报道了ATP-TCA指导化疗与传统化疗比较的临床Ⅱ期试验结果，表明ATP-TCA指导化疗治疗复发性卵巢癌较传统化疗模式有更高的有效率（65% Vs 45%），更长的总生存期和无进展生存期，两种化疗模式比较差异极其显著（P<0.0009 和P<0.0016）[13]。2001年，O'Meara等也报道了类似的临床试验结果[10]。
　　2003年Kurbacher等报道了ATP-TCA辅助化疗对卵巢癌和乳腺癌治疗的临床Ⅱ期试验结果，结果表明，ATP-TCA指导化疗能够显著提高临床疗效，延长病人生存期，与传统化疗模式比较差异极为显著（临床疗效75% Vs 35%，总生存期延长，分别为 28.5月Vs 14月，P<0.0001）[11]。目前德国汉堡大学医院、科隆大学医学中心以及英国Bath癌症研究中心等研究单位正在进行临床Ⅲ期试验，进一步评估ATP-TCA辅助化疗对卵巢癌和乳腺癌治疗的临床价值[11]。
　　在日本进行的临床研究也表明ATP-TCA辅助化疗显著提高了胃肠道肿瘤的治疗效果，延长了病人的生存期[3,14]。另一项日本的膀胱灌注治疗浅表性膀胱癌的临床研究表明药敏指导治疗组患者5年无复发率为80.9%，而经验化疗对照组无复发率仅为39.4%(P<0.001) [15]。这些研究结果表明，ATP-TCA指导下的个体化治疗显著提高了化疗用药的科学性，提高了疗效。
　　2.为非常规化疗癌种设计化疗方案：
　　ATP-TCA方法在对一些不多见或者所知不多的肿瘤设计治疗方案中得到了广泛的应用。眼脉络膜黑色素瘤是一种恶性程度及转移潜能较高的肿瘤。长期以来由于其发病率低、对大多数药物不敏感而难以找到有效的治疗药物。1997年开始，Kurbacher和Cree等人利用ATP-TCA方法在在筛选治疗眼脉络膜黑色素瘤的药物和治疗方案[31-37]。结果表明一些烷基化药物如treosulfan对黑色素瘤具有较强的细胞毒性作用，它与健择或阿糖胞苷组成的联合方案具有较高的有效率（体外有效率分别为70%和86%）[16-20]。Treosulfan与健择联合方案经临床Ⅱ期试验验证具有较好的临床疗效（客观有效率为60%）[21]。2000年，Breidenbach等利用该方法筛选治疗Stewart-Treves 综合症的化疗方案，发现紫素和米托蒽醌联合方案有效，经动脉内插管化疗病人达到完全缓解，3年内无复发[22]。在我国食管癌、非小细胞肺癌、消化道肿瘤（肉瘤和胰腺癌除外）等均为高发常见但又为非常规化疗癌种。通过药敏检测在体外筛选敏感药物，有可能为非常规化疗癌种提供新化疗方案，最终提高这些肿瘤的疗效。
　　3.作为研究和确定新的化疗方案和新的治疗原则的技术平台：
　　1997年Kurbacher等人利用ATP-TCA方法筛选卵巢癌治疗的三线化疗方案，体外结果表明紫素和米托蒽醌联合方案对于铂类药物耐受的卵巢癌具有一定的有效率(83%)[23]。该方案的临床Ⅱ期试验（米托蒽醌6mg/m2 2周一次，紫素100mg/m2 1周一次）结果表明，该方案临床疗效与体外药敏试验结果比较一致(客观有效率为78%)，病人中位无进展生存期为40周，该方案被推荐作为铂类药物耐受的卵巢癌的挽救治疗方案[24]。
　　2000年Neale等人利用该方法在复发卵巢癌中研究用药新方案，发现复发卵巢癌对于高浓度的阿霉素敏感，此外，高浓度阿霉素与去甲长春新碱具有协同作用[25，26]。2002年，他们报道的大剂量阿霉素（脂质体阿霉素）治疗复发卵巢癌的临床Ⅱ期试验结果表明，脂质体阿霉素对于复发卵巢癌具有一定的临床疗效（客观有效率为20%），同时初步临床资料表明大剂量阿霉素与去甲长春新碱联合方案具有较好疗效，认为在未来临床上值得进一步研究和推广[27]。
　　4.现有化疗方案疗效评估。
　　1996年Kurbacher等人利用ATP-TCA方法评估两个乳腺癌化疗药物—米托蒽醌（MX）和表阿霉素（EPI）的临床疗效，发现它们的疗效相近（EPI 62.5 %，MX 59.4 %），两者之间仅有轻微交叉耐药。因此，以此米托蒽琨为核心的联合用药方案可以作为阿霉素一线治疗以后的二线方案治疗乳腺癌[28,29]。
　　5.老药新适应症的筛选技术平台。
　　一个新药的问世要经历十几年的甚至更长时间的研究历程，投入大量的人力物力。进一步开发已经问世药物的新适应症和应用范围，是药物实现价值最直接和经济的途径。ATP-TCA方法建立了在不同原代肿瘤细胞平台上的老药新适应症的研究技术平台，可为国家和企业节约大量的研发资金和使现有药物更能充分发挥作用。
　　6.新抗肿瘤药研发和最佳适应症筛选的技术平台。
　　体外药敏试验对于临床药物研发和和适应症预测具有重大意义。近年来在欧洲和美国已经开始应用ATP-TCA方法在肿瘤细胞系和原代瘤组织培养基础上开展抗肿瘤药物筛选和研发 [30,31]。1992年，Hightower 等人合成了一种新的蒽环化合物U-73975，并且在卵巢癌、宫颈癌细胞系和瘤组织中应用ATP-TCA方法评估其体外细胞毒性，研究结果表明U-73975的杀伤作用比顺铂强3个数量级，而其对造血细胞、成纤维细胞以及正常上皮细胞的毒性仅相当于顺铂的十分之一[32,33]。同年，Untch等报道了利用该技术研究吡喃阿霉素对卵巢癌细胞的抑制作用，结果表明，吡喃阿霉素的体外有效率较阿霉素为高（60% Vs 29%），该体外检测结果与实际临床疗效一致（53% Vs 25%）[34]。
　　1999年，O'Meara等应用ATP-TCA方法体外评价CPT-11在卵巢癌中的应用价值，发现CPT-11及其联合方案对复发卵巢癌有较好的体外杀伤作用,其有效作用剂量显著低于血浆峰值浓度，细胞周期主要阻滞于S期[35]。CPT-11目前已成为铂类药物耐受性卵巢癌的挽救治疗药物。同年，Werkmeister等人应用该方法研究口腔癌症治疗时，报道Herceptin单抗对其具有一定的体外有效率[36]。 
　　Kurbacher等人已经应用ATP-TCA进行新药筛选、研发及临床疗效预测[30,31]。2000年与他们协作的Neale等人报道了一种能同时抑制DNA拓补异构酶Ⅰ和Ⅱ的人工合成化合物XR5000，卵巢癌和黑色素瘤的原代培养测试结果表明，其作用相当于拓补替康和足叶乙甙相加，初步临床研究显示它与紫素或铂类药物联合极大地改善了卵巢癌的治疗效果；此外，XR5000与treosulfan联合方案对于黑色素瘤的治疗疗效显著[37]。

　　三、ATP-TCA的临床应用和面临的挑战
　　ATP-TCA是较为理想的体外药敏检测技术，大量的研究工作已表明用该技术得到的体外药敏结果与体内反应的符合率高，该技术指导下的化疗比盲目凭经验用药的疗效好。然而，一种新的药敏检测技术的应用势必要有一个广大医生认识、认可、接受乃至修正的过程。笔者结合对该技术的了解和尚不成熟使用经验，提出该技术在应用方面要考虑的问题与同行进行商榷。
　　1.目前发达国家对该技术的认可程度。
　　1998年德国DCS公司将该技术产业化，并在欧洲和北美市场获得准入，其产品已在欧洲和美国正式应用于肿瘤患者临床个体化治疗。美国全国医疗保险协会(Health Maintenance Organization)认为，该技术是一项精确和可靠的并能指导医生选择用药的先进技术，在医生建议下可以使用，建议在全美进行医疗保险赔付。现美国在加州等6个州已获医疗保险赔付。日本厚生省和保险联合会也认为，该技术是一项先进的临床医学项目，在该技术指导的肿瘤化疗临床实验中，较传统的化疗方案能明显提高消化道肿瘤的治愈率。该项目现已在5所权威研究机构开展，并建议该项技术在全国范围内获得医疗保险赔付。
　　在国内ATP-TCA试剂盒已经获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准，获得市场准入。
　　2.该技术临床应用的风险及风险控制。
　　虽然该技术是一种先进的体外药敏检测技术，但体外实验环境与不可能完全模拟体内环境，二者的差异主要在两点，一是体外实验中肿瘤细胞已被分散成单细胞，可以与化疗药物充分接触，在体内显然不可能达到如此充分的接触；二是不同病人对化疗药的解毒或排泄功能有差异，体外实验无法体现这种差异。虽然大多数临床试验结果表明，该技术的阳性预测值，阴性预测值，特异性和敏感性方面均高于其它药敏技术，整体预测值约为75-86%之间。医生应清楚体外药敏实验的局限性，不可能100％预测准确，应对患者讲明利弊，结合临床经验并参考体外药敏结果对患者进行治疗。
　　3.与传统方案化疗理念上的冲突和统一。
　　恶性肿瘤的化疗，特别是固定联合方案化疗的治疗显著改善了肿瘤的治疗状态。方案化疗是当今肿瘤内科化疗的主流，同时也是遏止不规范化疗的有效手段之一。然而，在体外药敏实验平台下的肿瘤个体化治疗是一种客观有效的治疗模式和肿瘤内科的发展趋势，如何实现二者在化疗理念上的统一是医生即将面临的问题。目前即便是多种药物的联合化疗，仍然约有相当大比例的患者对治疗无效，特别是对化疗不敏感的肿瘤（如消化道肿瘤）对常规化疗的有效率更低。在临床治疗实践中，甚至有时会发现部分患者在用药后肿瘤反而迅速增长；体外药敏实验也表现为非但药物对肿瘤没有杀伤作用，反会促使癌细胞迅速生长，而且癌细胞生长速度具有明显的药物量效关系，表现出抗肿瘤药物对肿瘤细胞生长的促进作用。我们在体外研究联合化疗方案对患者癌细胞的杀伤时发现，有时联合方案所表现出的杀伤作用主要是其中一种药物的作用结果，或是某联合方案的杀伤作用低于其中某种单药对肿瘤细胞的杀伤效果，证实该药物组合影响了其中有效药物对该患者癌细胞的杀伤作用。抗肿瘤药物间对肿瘤细胞的杀伤作用过程是复杂的，但无可争议的是药敏检测技术平台的建立对于了解药物在体外对某位患者的肿瘤细胞对药物的敏感性是十分必要的。笔者认为，临床医师应将药敏实验结果作为用药前的参考指标，在确定联合方案时充分考虑到该位患者的实验结果，将传统治疗方案和药敏结果二者结合起来，不仅可增强用药的科学性，还可降低无效治疗的风险，同时医生也新增加了一件有益的工具。
　　4. ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测队伍的专业化培训是十分必要的。
　　从业药敏检测的人员除了具有一般的实验室操作和组织培养技能外，在药理学、临床医学和计算机方面要有一定的了解才能做好药敏检测工作。另外，由于受技术局限性的影响，该技术的应用要具备适当的条件和知识，例如肿瘤的类型，取材的部位，细胞的活性以及操作人员的技术水平等均会影响实验结果的判定。因此， 从业药敏检测的人员要经过技术培训后才能上岗。
　　总而言之，ATP生物荧光技术在肿瘤体外药敏检测中的应用已经有十余年的历史，其应用相关文献已逾200余篇。作为一种前途广阔的新的体外药敏检测方法，其在临床治疗研究、肿瘤患者的个体化治疗、新联合化疗方案的研究、新药最佳适应症的确定以及老药新适应症的研发过程中有实际应用价值，是目前国际上最先进的药敏检测主流技术。该技术的正确应用将对提高化疗用药的针对性和用药科学性产生重要影响。临床试验结果表明ATP生物荧光体外检测肿瘤化疗敏感性技术指导的化疗较传统化疗模式更能提高临床疗效，延长病人总生存期和无进展生存期。然而，由于受技术局限性的影响，例如肿瘤的类型，取材的部位，细胞的活性以及操作人员的技术水平等均会影响实验结果的判定。 因此，该技术的应用要稳健和科学的开展才能收到预期的效果。

参考文献

1 韩锐主编.肿瘤化学预防及药物治疗.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社.1991.417-418. 2 Sevin BU, Peng ZL, Perras JP, et al. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol Oncol, 1988, 31: 191-204. 3 Jinushi K, Hirabayashi N, Kirihara Y, Clinical studies of in vitro chemosensitivity test evaluated by ATP assay of gastrointestinal cancer. Gan To Kagaku Ryoho, 1990, 17: 2235-2239. 4 Koechli OR, Avner BP, Sevin BU, et al. Application of the adenosine triphosphate-cell viability assay in human breast cancer chemosensitivity testing: a report on the first results. J Surg Oncol, 1993, 54: 119-125. 5 Andreotti PE, Cree IA, Kurbacher CM, et al. Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Res, 1995, 55: 5276-5282. 6 Cree IA, Kurbacher CM, Untch M, Correlation of the clinical response to chemotherapy in breast cancer with ex vivo chemosensitivity. Anticancer Drugs, 1996, 7: 630-635. 7 Kawamura H, Ikeda K, Takiyama I, et al. The usefulness of the ATP assay with serum-free culture for chemosensitivity testing of gastrointestinal cancer. Eur J Cancer,. 1997, 33: 960-966. 8 Konecny G, Crohns C, Pegram M, et al. Correlation of drug response with the ATP tumorchemosensitivity assay in primary FIGO stage III ovarian cancer. Gynecol Oncol,. 2000, 77: 258-263. 9 Mollgard L, Tidefelt U, Sundman-Engberg B, et al. In vitro chemosensitivity testing in acute non lymphocytic leukemia using the bioluminescence ATP assay. Leuk Res, 2000, 24: 445-452. 10 O'Meara AT, Sevin BU. Predictive value of the ATP chemosensitivity assay in epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol. 2001, 83, 334-342. 11 Kurbacher CM, Grecu OM, Stier U, et al. ATP chemosensitivity testing in ovarian and breast cancer: early clinical trials. Recent Results Cancer Res, 2003, 161: 221-30. 12 张 凯 张文华 付军等 ATP生物荧光技术在卵巢癌体外药敏检测中的应用 《癌症进展》    2003.No.1 Vol.1:38. 13 Kurbacher CM, Cree IA, Bruckner HW, et al. Use of an ex vivo ATP luminescence assay to direct chemotherapy for recurrent ovarian cancer. Anticancer Drugs, 1998, 9: 51-57. 14 Kawano K. The experiment and clinical evaluation of chemosensitivity test for esophageal and gastric cancer by ATP assay using endoscopic biopsy. Nippon Geka Gakkai Zasshi, 1992, 93: 232-240. 15 Yamada S, Deguchi T, Nezasa S ,et al.Study on chemosenstivity test of urogenital tumors by ATP assay .Nippon Hinyokika gakkai Zasshi, 1996,87(12):1281-1288 16 Myatt N, Cree IA, Kurbacher CM, et al. The ex vivo chemosensitivity profile of choroidal melanoma. Anticancer Drugs, 1997, 8: 756-762. 17 eale MH, Myatt N, Cree IA, et al. Combination chemotherapy for choroidal melanoma: ex vivo sensitivity to treosulfan with gemcitabine or cytosine arabinoside. Br J Cancer, 1999, 79: 1487-1493. 18 Neuber K, tom Dieck A, Blodorn-Schlicht N, et al. Treosulfan is an effective alkylating cytostatic for malignant melanoma in vitro and in vivo. Melanoma Res, 1999, 9: 125-132. 19 Cree IA, Neale MH, Myatt NE, et al. Heterogeneity of chemosensitivity of metastatic cutaneous melanoma. Anticancer Drugs, 1999, 10: 437-444. 20 Neale MH, Myatt NE, Khoury GG, et al. Comparison of the ex vivo chemosensitivity of uveal and cutaneous melanoma. Melanoma Res, 2001, 11: 601-609. 21 Ugurel S, Tilgen W, Reinhold U. Chemosensitivity testing in malignant melanoma. Recent Results Cancer Res, 2003, 161: 81-92. 22 Breidenbach M, Rein D, Schmidt T, et al. Intra-arterial mitoxantrone and paclitaxel in a patient with Stewart-Treves syndrome: selection of chemotherapy by an ex vivo ATP-based chemosensitivity assay. Anticancer Drugs, 2000, 11: 269-273. 23 Kurbacher CM, Cree IA, Brenne U, et al. Heterogeneity of in vitro chemosensitivity in perioperative breast cancer cells to mitoxantrone versus doxorubicin evaluated by a microplate ATP bioluminescence assay. Breast Cancer Res Treat, 1996, 41: 161-170. 24 Kurbacher CM, Bruckner HW, Cree IA, et al. Mitoxantrone combined with paclitaxel as salvage therapy for platinum-refractory ovarian cancer: laboratory study and clinical pilot trial. Clin Cancer Res, 1997, 3: 1527-1533. 25 Nguyen HN, Sevin BU, Averette H, et al. Comparative evaluation of pirarubicin and adriamycin in gynecologic cancer cell lines. Gynecol Oncol, 1992, 45: 164-173. 26 Neale MH, Lamont A, Hindley A, Kurbacher CM, Cree IA. The ex vivo effect of high concentrations of doxorubicin on recurrent ovarian carcinoma. Anticancer Drugs, 2000, 11: 865-871. 27 Di Nicolantonio F, Neale MH, Knight LA, et al. Use of an ATP-based chemosensitivity assay to design new combinations of high-concentration doxorubicin with other drugs for recurrent ovarian cancer. Anticancer Drugs, 2002, 13: 625-630. 28 Kurbacher CM, Brenne U, Kurbacher JA, et al. Comparison of the cytostatic effect of epirubicin and mitoxantrone on native breast carcinoma cells using the ATP tumor chemosensitivity assay.Zentralbl Gynakol, 1996, 118: 271-278. 29 Kurbacher CM, Cree IA, Brenne U, et al. Heterogeneity of in vitro chemosensitivity in perioperative breast cancer cells to mitoxantrone versus doxorubicin evaluated by a microplate ATP bioluminescence assay. Breast Cancer Res Treat, 1996, 41: 161-170. 30 Cree IA.Chemosensitivity testing as an aid to anti-cancer drug and regimen development. Recent Results Cancer Res, 2003, 161: 119-125. 31 Cree IA, Kurbacher CM. ATP-based tumor chemosensitivity testing: assisting new agent development.Anticancer Drugs, 1999, 10: 431-435. 32 Hightower RD, Sevin BU, Perras JP, et al. Comparison of U-73,975 and cisplatin cytotoxicity in fresh cervical and ovarian carcinoma specimens with the ATP-chemosensitivity assay. Gynecol Oncol, 1992, 47: 186-190. 33 Hightower RD, Sevin BU, Perras J, In vitro evaluation of the novel chemotherapeutic agents U-73975, U-77779, and U-80244 in gynecologic cancer cell lines. Cancer Invest, 1993, 11: 276-82 34 Untch M, Sevin BU, Perras JP, et al. Chemosensitivity to the new anthracycline pirarubicin and other chemotherapeutic agents in primary and recurrent ovarian tumors in vitro. Gynecol Oncol, 1992, 47: 172-178. 35 O'meara AT, Sevin BU. In vitro sensitivity of fresh ovarian carcinoma specimens to CPT-11 (irinotecan). Gynecol Oncol, 1999, 72: 143-147. 36 Werkmeister R, Fillies T, Brandt B, et al. Chemosensitivity testing of oral cancer cells treated with a p185neu-specific agent. Eur J Oral Sci,. 1999, 107: 338-343. 37 Neale MH, Charlton PA, Cree IA. Ex vivo activity of XR5000 against solid tumors. Anticancer Drugs, 2000, 11: 471-478