ATP－生物荧光体外抗癌药物敏感性检测         技术简介                       北京多赢时代循证医学研究中心 医科院肿瘤医院肿瘤生物检测中心

	一、概要 　　化学治疗是恶性肿瘤三大经典治疗方法之一，其趋势倾向于常规治疗。由于肿瘤对化疗药物的敏感性存在个体差异，以及肿瘤细胞具有多重抗药性（原、继发性），导致相同药对同一类型患者的治疗效果不同。而不正确的治疗会伤及机体的免疫功能和降低体能导致治疗的失败。因此，如何提高化疗用药的针对性和有效性从而实现针对性较强的个体化治疗是多年来国际上肿瘤研究领域的重要课题之一。 　　中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所经多年研究，在国内首先研发成功并生产 “ATP-生物荧光体外抗肿瘤药物敏感性检测试剂盒”。该技术的应用，医生可以在了解癌症患者药物敏感和耐药谱的基础上有针对性的选择药物，为临床制定化疗方案提供直接、客观的依据，提高了化疗用药的针对性、有效性、科学性以及癌症病人的治愈率。该产品已被国家食品药品监督管理局（SFDA）批准应用于临床。 　　该技术是建立在检测肿瘤细胞ATP水平反映药物对细胞杀伤程度的先进技术，实现了操作过程标准化，在检测过程中采用荧光扫描技术实现了高通量筛选（同时筛选数十种药物），并经计算机分析处理，快速、准确、客观地对多种药物的敏感性做出评价，为受试癌症病人提出敏感和耐药的药物清单和程度顺序，为医生提供客观用药的参考指标，对实现化疗方案“个案化”具有重要价值。 　　ATP-生物荧光体外抗肿瘤药物敏感性检测试剂盒的研制成功不仅填补了国内空白，而且使我国成为继德国之后第二个独立拥有该技术知识产权的国家，其主要技术指标和性能均已达到或超过德国同类产品的水平。经北京市科委组织专家鉴定，认为该产品已达到国际先进水平。其中，在国际上首次研制出“体外肿瘤细胞选择性生长培养基”，进一步提高检测的特异性。由于该技术的创新性和领先性2003年获得国家科技部“中小企业创新基金”资助。申请发明专利一项。 二、技术创新性 　　1、基本技术原理 　　细胞内源性ATP含量与活细胞活力呈正相关。因此，测定细胞内源性ATP的含量可以反映细胞的活性和活细胞数量。荧光酶（luciferase）在有氧条件下,可以和荧光素（luciferin）结合后催化ATP转变成AMP,并且释放出荧光光子（波长为562nm）。测定所产生的荧光强度,计算ATP的含量，可推测出活细胞的数量，最终计算出各种药物对肿瘤细胞的杀伤活性。 　　2、本试剂的关键技术内容 　　⑴ 基因重组热稳定荧光素酶的研制 　　天然荧光素酶本身热稳定性很差，不能满足试剂稳定性要求，因此我们经基因克隆、点突变、发酵和表达纯化出了热稳定性良好、发光效率高的重组荧光素酶，解决了核心试剂荧光素酶的自给和稳定性。 　　 我们自产的高效重组荧光素酶较德国同类试剂盒酶系统具有相同的热稳定性及发光效率。如右图所示。 图中JZJ代表自产试剂；DCS代表德国DCS公司试剂（以下同）。 　　⑵ 在国际上首先发明了肿瘤细胞选择性培养基 　　由于手术取得肿瘤标本中的肿瘤细胞所占比例只有10-30%，因此要体现药物对肿瘤细胞的特异性杀伤作用，降低非肿瘤细胞对实验的干扰是药敏检测成败的关键问题。为此，我们在国际上首先发明了肿瘤细胞选择性培养基，采用营养缺陷、加入凋亡因子及促进肿瘤细胞生长增殖的细胞因子和营养元素使肿瘤细胞经培养得到迅速增殖而非肿瘤细胞生长被抑制，经培养后的肿瘤细胞可由原来的20%扩增到75%，解决了困扰药敏检测技术发展几十年的关键技术问题，从而保证检测结果的特异性和可靠性。

	经选择性培养基培养的细胞生长性能的比较表  表－2    项　　目  平均克隆 形成率  标本培养 成功率  内毒素 含量  是否含 血清  原代培养克隆 形成率  自产培养基      30%  >95%  <0.2u/ml   否  1%-5%  德国培养基      <20%  70%  <0.5u/ml  否  <1%  经选择性培养基培养前后细胞成分变化比较表  表－3   项    目 培养前细胞组成 5-7天培养后细胞组成 淋巴 细胞 上皮 细胞 成纤维细胞 肿瘤细胞 淋巴 细胞 上皮细胞 成纤维细胞 肿瘤 细胞 自产培养基 40-50% 30-40% 5-10% 5-10% <0.1% <1% <10% >75% 德国培养基 1%-5% 10-15% 20-30% 40-55% 　　⑶ 对损伤细胞进行修复 　　肿瘤标本经消化或进行红细胞裂解时将受到一定程度的损伤，影响细胞的生长和克隆形成。因此，我们在洗涤过程利用相应的细胞因子和营养元素对其进行修复，保证肿瘤细胞的自然生长状态，从而增加了标本中有效肿瘤细胞的获得数量，提高了药敏检测的成功率。 　　⑷ 检测分析的自动化 　　为提高检测分析的自动化，我们开发了相应的检测、统计分析软件，实现发光分析仪与电脑一体化，满足高通量筛选的要求。该系统具有操作简便，检测效率高（同时动态检测评估16个药物，6个药物剂量）、自动化程度高（检测数据通过发光分析仪扫描和计算机软件自动分析，并配有图象分析，结果直观可靠），高通量测定及敏感性特异性好的特点，有效避免常规实验操作当中出现的偶然误差而造成的假阴性和假阳性。 　　⑸ 与进口试剂整体技术水平的比较，本试剂整体技术水平高于进口试剂。  表－4 项    目 自产技术 德国产试剂盒 最小检出细胞数 10 78 空白本底值 <100 320 精密度 低浓度<10% 中浓度<5% 高浓度<5% <10% 稳定性 六个月 6个月 标本可评价率 90% 76% 与临床符合率 92% 87% 灵敏度 94% 85% 特异性 91% 90% 三、ATP-肿瘤药敏检测技术的应用 　　1、适用的肿瘤标本类型 　　　　实体瘤标本、胸腹水、活检淋巴结 　　2、本试剂的主要用途 　　⑴   为肿瘤患者筛选个体化治疗方案； 　　⑵   对现有化疗方案的疗效进行评估； 　　⑶   为新的化疗方案提供研究技术平台； 　　⑷   提供新适应症的筛选技术平台； 　　⑸   高通量的抗肿瘤新药筛选技术。

	四、开展ATP-肿瘤药敏检测的技术条件和检测方法 　　（一）技术条件 　　1、实验室和仪器设备  　　 20～40平方米的实验室，超净工作台，发光分析仪，CO2细胞培养箱，离心机，倒置显微镜，电脑，以及组织培养所需的血细胞计数板，多道加样器等常规组织培养技术所需技术条件。 　　2、人员 　　具备组织培养和微机操作经验的技师2人。 　　3、所需经费 　　大约20～30万元。如果在组织培养实验室的基础上开展本项目仅需添置发光分析仪，约10-20万元。 　　（二）检测方法 　　1、操作步骤： 　　⑴ 标本的处理和运送: 　　① 实体瘤标本的处理、运送 　　为了获得足够数量活的肿瘤细胞，要切取血供丰富的肿瘤细胞较多、未坏死液化的瘤组织标本不小于1.0克。取出标本后应立即浸入RPM11640溶液中,并在最短时间内（3小时内）送抵实验室。用PBS清洗其表面，将标本置于标本浸泡液中浸泡15分钟。 　　② 胸腹水标本的处理、运送 　　因胸腹水中细胞数量多少不一，应尽量多收集标本，不少于500ml，按 20u/ml的浓度加入肝素抗凝。 　　⑵ 肿瘤细胞悬液的制备 　　① 实体瘤 　　　A、组织消化液配制：将10ml培养基加入到组织消化酶冻干瓶中充分混合溶解，吸出置于50ml无菌塑料离心管中待用。 　　　B、除去标本浸泡液，剥离肿瘤标本表面的结缔组织、纤维和脂肪，用无菌剪刀将标本剪碎成1mm的碎块，然后将其转移至含组织消化液的离心管中。 　　　C、将离心管倾斜置于37℃孵育箱中孵育1.5～3小时，每隔15～30分钟振摇一次,使其充分消化。 　　　D、将消化好的混合液通过细胞筛,如果团块较多，可以用注射器芯轻轻研磨，以辅助细胞分散。 　　　E、洗涤细胞。 加入25ml培养基，混匀后400g离心10分钟，去上清。如红细胞 >25%时应去除红细胞。然后加入25ml培养基混悬沉淀物，400g离心8～10分钟，去上清。加入3～5ml培养基混匀，制备成细胞悬液。    　　　F、细胞计数。 吸取一定量的细胞悬液，适当稀释后台盼蓝染色计数，包括不含红细胞的各类细胞总数、大细胞数、细胞存活比率。 　　② 胸腹水标本的制备 　　　A、将肝素抗凝的胸腹水标本， 400g离心10分钟，弃上清。 如有大量红细胞 （>25%），去除。加入20ml培养基混悬沉淀物，400g离心8～10 分钟，去上清，加入3～5ml培养基混匀制备得细胞悬液。 　　　B、细胞计数。方法同上。 　　　C、培养肿瘤细胞系 　　　　C-1、贴壁细胞。用0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA消化细胞，收集后用20ml培养基400g离心10分钟，弃上清，用3ml培养基混匀细胞，计数后备用。 　　　　C-2、悬浮细胞。400g离心10分钟，去上清，用3ml培养基混匀细胞，计数后备用。 　　〔3〕、去除红细胞（注：此操作的前提是有足够的细胞可用） 　　第一次离心后，去除上清，加入预冷的10ml红细胞裂解液，使细胞悬浮，冰浴5分钟后加入20ml培养基，200g离心8-10分钟，去上清。红细胞较多的胸腹水标本，冰浴时间延长15-20分钟，并轻摇两次。 　　〔4〕、加药步骤 　　①、准备待测化疗药物 　　根据待测药物的临床使用剂量及其所对应的血浆峰值浓度，设定6个检测浓度,即200%、100%、50%、25%、12.5%、6.25%的PPC。每个浓度作2个平行孔。同时设定M0：ATP最大吸收孔，Mi：100%活细胞抑制孔。 　　　A、用培养基（建议10ml）来配制800％PPC的待测药物。 　　　B、用多道加样器，向每个检测孔和G1-G12孔（M 0 ）中加入0.1ml培养基。 　　　C、用多道加样器，在H1-H12孔中加入0.1ml ATP生成抑制剂，即M i 孔（进行下一步前请更换吸头）。 　　　D、用可调加样器，向A行孔中加入0.1ml 800％PPC的待测药物。 　　　E、用多道加样器，从A→F行倍比（2×）稀释药液，最后的0.1ml弃去。这样从A行到F行，药物的浓度是400％-12.5％PPC。

	②、细胞接种和培养 　　一般情况下，细胞接种数量在2～4万/孔之间可以得到比较好的试验结果。细胞接种数量和接种时大细胞（大多数单核细胞）所占的比例有重要关系。 　　　A、计数后，确定接种细胞量。用培养基稀释至细胞密度为20～40万/ml。 　　　B、用多道加样枪，从A行到F行，每孔加入0.1ml的细胞悬液,这样，从A行到F行每孔的细胞数为2～4万个,而药物浓度为200％～6.25％PPC。 　　　C、加完细胞悬液后更换加样枪头，用多道加样器，将A1到F1，A2到F2A 　　⑸ 肿瘤细胞生长状态观察 　　肿瘤细胞接种以后在孵箱中培养5～7天。在此期间应该对肿瘤细胞生长状态进行观察，以便及时了解细胞培养情况，如有无细菌或真菌污染，接种是否均匀，肿瘤细胞是否贴壁和伸展，以及其克隆生成情况。隔天观察一次为宜。  　　⑹ ATP的提取及荧光测定 　　完成5～7天培养后，即可提取细胞ATP进行测定。 　　① ATP的提取 　　　A、配制荧光酶-荧光素系统工作液。 将12ml荧光酶工作液加入到荧光酶-荧光素系统中，充分溶解混合配成发光工作液，室温避光放置10分钟。 　　　B、用多道加样器自A-G，H(换枪头)行顺序将ATP提取液加入96孔培养板， 每孔加入 50ul，室温静置5分钟，等待测定。 　　② 荧光测定 　　　A、完成ATP提取以后，用多道加样器自96孔培养板A～G，H顺序依次吸出 50ul上清液，对应加入到荧光测定板中。 　　　C、在荧光测定板中每孔加入50ul发光工作液，在微量振荡器上振荡10秒钟，立刻用发光分析仪测定。 　　⑺ ATP标准曲线绘制 　　① 每次实验都需绘制ATP标准曲线来定量评估待测细胞ATP的含量。 　　② 向ATP冻干瓶内加入无菌去离子水2ml，充分溶解，溶液浓度为250ng/ml。 　　③ 系列稀释ATP溶液，ATP含量依次为：250、83.3、27.4、9.1、3.0、1、0.33、0.11ng/ml加入配好的发光工作液，每个浓度取50ul，设2个平行孔即刻进行测量。 　　④ 以每个梯度平均荧光值为纵坐标，ATP含量对数值为横坐标做标准曲线，计算相关系数和变异系数。 　　2、自动数据传输和分析 　　检测的数据传输到计算机并自动生成EXCEL表格形式文件。该表格已经预设定好了公式，用来计算每种药物每个浓度的肿瘤生长抑制率，绘制抑制曲线图。将药物相对百分比浓度和相应抑制率输入SPSS软件包进行分析，计算各药物的IC 50 和IC 90 。 　　3、评价标准 　　高度敏感：IC 50 <25%PPC及IC 90 <100%PPC 　　中度敏感：IC 50 <25%PPC及IC 90 >100%PPC 　　轻度敏感：IC 50 >25%PPC及IC 90 <100%PPC 　　耐药：IC 50 >25%PPC及IC 90 >100%PPC 　　说明：IC 90 ：抑制90%肿瘤生长时的血浆峰值浓度百分比 　　　　　IC 50 ：抑制50%肿瘤生长时的血浆峰值浓度百分比 　　　　　PPC：一定临床用药剂量对应的血浆峰值浓度 五、试剂盒组成: 　　① 组织消化酶 ×2 瓶/冻干 　　② ATP提取液 ×1瓶/25ml 　　③ 96孔培养板×4 块 　　④ 荧光酶-荧光素系统×2瓶/冻干 　　⑤ 培养基 ×1 瓶/200ml 　　⑥ ATP生成抑制剂 ×1瓶/10ml 　　⑦ 红细胞裂解液 ×1瓶/25ml 　　⑧ 荧光酶工作液 ×1瓶/25ml 　　⑨ ATP标准 ×1瓶/冻干 　　⑩ 说明书  1份

	中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院 肿瘤生物学检测中心 抗肿瘤药物药敏检测报告  姓名：    性别：  女  病案号：     科室：     床号：    肿瘤部位：      病理类型及分级：   结肠癌肝转移  是否经历化疗：            取样时间：           申请化疗药物种类共计16份：  1. 5-FU 　2. CPT-11  3. MMC 　4. HCPT  5. VCR 　6. THP  7. NVB 　8. GEM  9. L-OHP+5-FU+CF  10. 5-FU+DDP  11. CPT-11+5-FU+CF  12. PTX+CBP+BCNU  13. NVB+EPI  14. HCPT+5-FU+CF  15. GEM+DDP  16. 5-FU+VCR 实验结果：  强敏感药物：  无  敏感药物：  5-FU+DDP，PTX+CBP+BCNU  中度敏感药物：   L-OHP+5-FU+CF，CPT-11+5-FU+CF，HCPT+5-FU+CF，GEM+DDP，HCPT，NVB  轻度敏感药物：   无  耐药药物：  NVB+EPI，5-FU+VCR，MMC，THP，GEM，5-FU，VCR，CPT-11    注：本检测报告仅供临床医师用药参考

	研发单位：中国医学科学院肿瘤医院、肿瘤研究所 生产单位：北京金紫晶生物医药技术有限公司 区域代理：           总代理商：北京多赢时代科技有限公司 联系方式： 电话：010-67358329 67346743（fax） 地址：北京市朝阳区松榆北路2号兆佳商务楼318室 邮编 100021 网站：WWW.doing-times.com E-mail:info@doingtimes.com